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本试剂盒可用于一步法RT-PCR实验，逆转录和PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂中包括高效逆转录酶、新型热启动DNA聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR扩增的反应缓冲液。高效逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。该逆转酶逆转录效率高，可对少量RNA模板进行良好的逆转录反应。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、特异性强的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用本试剂扩增得到的目的产物3′端附有一个"A"碱基，可直接用于T/A克隆。

• 将RNA模板、引物、5×SuperRT OneStep Buffer、Enzyme Mix、10×Enhancer和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
  
• 根据以下表格配制反应体系：
  

  成分	25μL体系	50μL体系	终浓度
  5×SuperRT OneStep Buffer	5μL	10μL	1×
  Primer 1 10μM	0.5～1μL	1～2μL	0.2～0.4μM
  Primer 2 10μM	0.5～1μL	1～2μL	0.2～0.4μM
  Enzyme Mix	1μL	2μL
  10×Enhancer	2.5μL	5μL	1×
  RNA Template	0.5～2μL	1～4μL
  DEPC处理水	至25μL	至50μL

  注：引物浓度请以终浓度0.1～1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
  
• 涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
  
• 将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按如下条件进行RT-PCR反应：
  

  过程	温度	时间	循环数
  反转录	50℃	15min	1
  预变性	95℃	2.5min	1
  变性	95℃	20s	35～50个
  退火	50～65℃	25s
  延伸	72℃	60s/kb
  终延伸	72℃	10min	1

  注意：
  
  • 一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20～30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
    
  • 延伸时间根据扩增的片段大小设定，本制品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1kb/60s。
    
  • 可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
• 反应结束后取5μL反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。